זיהוי חומצות גרעין של וירוסים

הרצפים הגנומיים של רוב הנגיפים היו ידועים.בדיקות חומצות גרעין שהן מקטעים קצרים של DNA שנועדו להכלאה עם מקטעי DNA ויראלי משלימים או RNA.תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) היא טכניקה יעילה יותר לזיהוי ויראלי.לאחרונה פותחו שיטות אבחון בתפוקה גבוהה.

א טכניקת הכלאה של חומצות גרעין

הכלאה של חומצת גרעין, הכוללת בעיקר סיכה דרומית (דרום) וסתימה צפונית (צפונית), היא טכניקה חדשה המתפתחת במהירות בתחום אבחון הנגיפים.הרציונל של מבחן ההכלאה הוא להשתמש במקטעים קצרים של DNA (הנקראים "בדיקה") המיועדים להכלאה עם מקטעי DNA ויראלי משלימים או RNA.על ידי חימום או טיפול אלקליין, DNA או RNA מטרה דו-גדילי מופרדים לגדילים בודדים ולאחר מכן הם משותקים על תומך מוצק.לאחר מכן, בדיקה מתווספת ומכלאה עם ה-DNA או ה-RNA של המטרה.מכיוון שהבדיקה מסומנת עם איזוטופ או נוקליד לא רדיואקטיבי, ניתן לזהות את ה-DNA או ה-RNA היעד באמצעות אוטורדיוגרפיה או על ידי מערכת הביוטין-אבידין.מכיוון שרוב הגנומים הנגיפיים שובטו ורצפו אותם, ניתן לזהות אותם באמצעות רצפים ספציפיים לווירוס כבדיקות בדגימה.נכון להיום, שיטות ההכלאה כוללות: כתם נקודות, הכלאה באתרו בתאים, ספיגת DNA (DNA) (Southern blot) ו-RNA blotting (RNA) (Northern blot).

טכנולוגיית B.PCR

בשנים האחרונות פותחה סדרה של טכניקות הגברה של חומצות גרעין במבחנה המבוססות על PCR, לבדיקת וירוסים לא רגישים או לא ניתנים לגידול.PCR היא שיטה שיכולה לסנתז רצף DNA ספציפי על ידי תגובת פולימראז במבחנה.תהליך ה-PCR כולל מחזור תרמי של שלושה שלבים: דנטורציה, חישול והרחבה בטמפרטורה גבוהה (93℃~95℃), ה-DNA הדו-גדילי מופרד לשני גדילי DNA בודדים;לאחר מכן בטמפרטורה נמוכה (37℃ ~ 60℃), שני פריימרים נוקלאוטידים מסונתזים מתחלשים למקטעי ה-DNA המשלימים;בעוד שבטמפרטורה המתאימה לאנזים Taq (72℃), סינתזה של שרשראות DNA חדשות מתחילה מ-primer 3'end תוך שימוש ב-DNA משלים כתבניות ונוקלאוטידים בודדים כחומרים.אז לאחר כל מחזור, ניתן להגביר שרשרת DNA אחת לשתי שרשראות.חזרה על תהליך זה, כל שרשרת DNA המסונתזת במחזור אחד יכולה לשמש כתבנית במחזור הבא, ומספר שרשראות ה-DNA מוכפל בכל מחזור, מה שאומר שהייצור של PCR מוגבר במהירות 2n log.לאחר 25 עד 30 מחזורים, ייצור PCR מזוהה באמצעות אלקטרופורזה, וניתן לצפות בתוצרי ה-DNA הספציפיים תחת אור UV (254 ננומטר).לטובת הספציפיות, הרגישות והנוחות שלו, PCR אומץ באבחון קליני של זיהומים ויראליים רבים כגון HCV, HIV, CMV ו-HPV.מכיוון שה-PCR רגיש מאוד, הוא יכול לזהות DNA של וירוס ברמת fg, הפעולה צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע חיובי שגוי.בנוסף, תוצאה חיובית בבדיקת חומצת גרעין לא אומרת שיש וירוס זיהומי חי בדגימה.

עם יישום רחב של טכניקת PCR, טכניקות ושיטות חדשות מפותחות המבוססות על טכניקת PCR למטרות בדיקה שונות.לדוגמה, ה-PCR הכמותי בזמן אמת יכול לזהות עומס ויראלי;ב-PCR באתרו משמש לזיהוי זיהום בנגיף ברקמה או בתאים;ה-PCR המקונן יכול להגביר את הספציפיות של PCR.ביניהם, PCR כמותי בזמן אמת פותח מהר יותר.טכניקות חדשות רבות, כגון בדיקה הידרוליזה של TaqMan, בדיקת הכלאה ובדיקת משואות מולקולרית, שולבו לטכניקת PCR כמותית בזמן אמת, שנמצאת בשימוש נרחב במחקר קליני.מלבד זיהוי העומס הנגיפי בנוזל הגוף של החולים במדויק, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לזהות מוטנט סובלני לתרופות.לכן, PCR כמותי בזמן אמת מיושם בעיקר בהערכת אפקט מרפא ומעקב אחר סבילות לתרופות.

ג.זיהוי תפוקה גבוהה של חומצות גרעין ויראליות

כדי לענות על הצרכים לאבחון מהיר של מחלות זיהומיות חדשות, הוקמו שיטות שונות לזיהוי תפוקה גבוהה, כמו שבבי DNA (DNA).עבור שבבי DNA, בדיקות ספציפיות מסונתזות ומוצמדות לשבבי סיליקון קטנים בצפיפות גבוהה מאוד ליצירת מיקרו-מערך בדיקה של DNA (DNA) שניתן להכלאה עם דגימה.ניתן לצלם את אות ההכלאה על ידי מיקרוסקופ קונפוקאלי או סורק לייזר ולהיות עיבוד נוסף על ידי המחשב וניתן לקבל מערך נתונים עצום הנוגע לגנים שונים.ישנם שני סוגים של שבבי DNA."שבב הסינתזה" הוא כדלקמן: האוליגונוקלאוטידים הספציפיים מסונתזים ישירות על השבבים.אחר הוא שבב מאגר DNA.הגנים המשובטים או מוצרי PCR מודפסים בצורה מסודרת על השקף.היתרון של טכנולוגיית שבבי DNA הוא זיהוי סימולטני של כמות עצומה של רצפי DNA.הגרסה העדכנית ביותר של שבב זיהוי פתוגנים יכולה לזהות למעלה מ-1700 וירוסים אנושיים בבת אחת.טכנולוגיית שבבי DNA פתרה את הבעיות של שיטות הכלאה מסורתיות של חומצות גרעין ויש לה יישומים רחבים מאוד באבחון ויראלי ובמחקר אפידמיולוגי.